Donate - Поддержка фонда Ф.Б.Березина

Изяслав Лапин. Стресс. Тревога. Депрессия. Алкоголизм. Эпилепсия. 9

Глава 4, часть 3

 

Модели тревоги на животных. Влияние эталонных анксиогенов на разные виды спонтанной двигательной активности (контроль к опытам на моделях тревоги). Общим в действии «анксиогенных» доз (на моделях тревоги на мышах) всех 5 эталонов анксиогенов: коразола (1,25-20 мг/кг), кофеина (12,5-200 мг/кг), йохимбина (0,5-8 мг/кг), фенамина (1,25-5 мг/кг) и фенилэтиламина (1,25-10 мг/кг) было только торможение вертикальных движений (их интенсивности, количества и времени). Максимальные дозы всех препаратов, кроме фенамина, тормозили горизонтальную активность. Остальные 12 показателей ориентировочной двигательной активности либо не изменялись (время у стенок и время в центре, локомоция по и против часовой стрелки, время в углах), либо изменялись разнонаправленно (груминг тормозился коразолом и кофеином, усиливался фенамином и фенилэтиламином). Поэтому во избежание ошибок в понимании результатов опытов на моделях тревоги (приподнятый крестообразный лабиринт, камера «свет-темнота», тест общения — «социального взаимодействия» и др.), основанных на измерении перемещений животных, необходим специальный строгий контроль влияния разных препаратов и других воздействий на двигательную активность.

Из лабораторных животных чаще используют мышей разных линий. Данные, полученные на этом виде животных, как правило, не отличаются от результатов опытов, выполненных на других видах лабораторных животных. Но они имеют во много раз меньшую массу тела (для примера мышь весит примерно 20 г, а крыса — 200-250 г), благодаря чему расход препаратов (дозы определяют, как известно, в миллиграммах на 1 кг массы тела), в том числе дефицитных и дорогостоящих, значительно меньше. Наиболее существенным преимуществом является то, что не возникает особых затруднений при экстраполяции экспериментальных данных, полученных на мышах, на человека.

Из моделей тревоги на мышах ниже приведены самые простые, быстрые и широко применяемые: 1) камера «свет-темнота» (dark-light chamber), 2) социальная изоляция или тест общения (social interaction test), 3) приподнятый крестообразный лабиринт (elevated plus-maze). Именно эти модели наиболее детально опробованы в нашей лаборатории в течение многих лет.

1). Камера «свет-темнота» (КСТ)

КСТ представляет собой устройство для измерения поведения в конфликтной ситуации — конфликт между ориентировочно-исследовательской мотивацией, направленной на ознакомление со всей камерой, и норковым рефлексом — убеганием в предпочитаемый темный отсек. Обычно на этой модели используют 2 показателя поведения: частоту переходов между отсеками и время пребывания в темном отсеке (предпочтение темноты). В начале 80-х годов сообщалось (Crawley, 1981,1982), что диазепам и несколько других производных бензодиазепинов учащают переходы между светлым и темным отсеками. Этот эффект был признан характерным для бензодиазепиновых транквилизаторов. Однако опыт работы с КСТ в течение 4 лет (150 групп трех линий мышей самцов; беспородных (или SHR), C57Bl/6 и CC57Br показал (Лапин И.П.,1991)), что ни один из исследованных препаратов в широком диапазоне доз не вызывал достоверного стабильного изменения ни частоты переходов, ни предпочтения темноты. Было испытано 5 стандартных анксиолитиков (диазепам, хлордиазепоксид, феназепам, буспирон, фенибут) и 3 стандартных анксиогена (кофеин, коразол, йохимбин). Лишь в единичных опытах наблюдали достоверные эффекты, признанные характерными. Поэтому было сделано заключение, что КСТ не может служить надежным устройством модели тревоги на мышах.

В дальнейшем оказалось (Лапин И. П., 2000), что другой показатель - частота выглядываний из темного отсека — является единственным надежным при исследовании анксиолитиков и анксиогенов в разные сезоны года, при обычных колебаниях комнатной температуры (в пределах 20-22°С) и сочетания искусственного и естественного освещения (освещенность в светлом отсеке от 60 до 100 люксов и в глубине темного отсека от 2 до 5 люксов). Первые достоверно и воспроизводимо учащают частоту выглядываний, вторые — достоверно и воспроизводимо урежают ее. Выглядывания очень просто и надежно считать, приняв за полное выглядывание высовывание головы, когда оба уха находятся уже в светлом отсеке. Контроль локомоции проводился по количеству пересеченных линий на полу светлого отсека при открытом и при закрытом проходе между отсеками. Размеры камеры: темный отсек – 8x15x14 см, светлый — 14x15x14 см; диаметр отверстия между отсеками — 3 см; высота над полом — 1 см.

2). Тест социальной изоляции (ТСИ)

Преимуществом выполнения теста на мышах по сравнению с использованием крыс является то, что достаточно суточной изоляции, в то время как в случае использования крыс требуется 5-7-суточная изоляция. При парном взаимодействии крыс намного больший удельный вес имеет связанная с охраной территории агрессивность, для уменьшения которой рекомендуют применять только камеры, не известные животным (Sams-Dodd F. 1995).

Используют два показателя поведения: количество контактов (обнюхиваний) и их продолжительность. Сравнение этих показателей позволило установить (Лапин И. П., 2000), что изменение суммарного времени контактов (по накопительному секундомеру) — удлинение под влиянием анксиолитиков и укорочение под влиянием анксиогенов воспроизводимо намного лучше, чем изменение количества контактов — увеличение после анксиолитиков и уменьшение после анксиогенов.

Компьютерная видеотехника позволяет получать количественные данные о социальном взаимодействии крыс, совпадающие, по результатам корреляционного анализа, с цифрами, регистрируемыми визуально-мануальным способом (Sams-Dodd F. 1995). Однако эта техника не может дифференцировать социальные и агрессивные контакты. Необходимым контролем в ходе эксперимента в ТСИ является одновременное с подсчетом длительности и количества контактов измерение локомоции в камере (в наших опытах размеры 15x20x10 см). Непосредственное перед опытом помещение одиночной мыши в ту же камеру на 5 мин для угашения ориентировочной активности улучшает результаты теста за счет значительного уменьшения индивидуальных различий в локомоции.

3). Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ).

Показатели, по которым наиболее часто оценивают поведение в этой модели и эффекты анксиогенов и анксиоли- тиков: 1) отношение числа заходов в открытые рукава к сумме заходов в открытые и закрытые рукава (ОЗ) и 2) время заходов в открытые рукава (ВО). Суммарное количество заходов в открытые и закрытые рукава используют как показатель общей двигательной активности. Однако этот показатель не всегда точен, так как интактные мыши, у которых зарегистрировано одинаковое суммарное количество заходов в рукава могут иметь достоверно разную локомоцию внутри закрытых рукавов, по которой их разделяют на быстрых и медленных (Lapin, 1995).

Анксиогены значительно снижают ОЗ (за счет уменьшения числителя — числа заходов в открытые рукава) и укорачивают ВО. Контрольные эксперименты показали (Lapin, 1995), что внутрибрюшинная инъекция физиологического раствора дает те же эффекты в сравнении с интактными особями, взятием в руки и ложной инъекцией. Следовательно, стресс инъекции физиологического раствора является значимым для модели фактором анксиогенного профиля. Взятие в руки и другие моменты фармакологического эксперимента настолько сильно влияют на животных, что это проявляется в изменении плотности бензодиазепиновых (Ragoet al., 1988), β-адрено- и 2А-серотониновых (Stanford, 1995) рецепторов.

ПКЛ оказался довольно «капризным» тестом: его результаты зависят от множества факторов, из-за чего результаты тестирования даже стандартных анксиогенов и анксиолитиков бывают противоречивыми. Это установлено (Hogg, 1996) специальным опросом 65 лабораторий, пользовавшимся ПКЛ в течение последних 3 лет. Так, в наших экспериментах неожиданной «загвоздкой» оказалось то, что и в контроле, и в исходных пробах всех групп мышь, помещенная на перекресток открытых и закрытых рукавов, тотчас убегала в один из закрытых рукавов и не покидала его на протяжении всего 4-минутного сеанса, хотя и перемещалась активно внутри этого рукава. В наших опытах мы сначала не сталкивались с таким осложнением. Пришлось изменить процедуру и начинать опыт с помещения мыши на конец открытого рукава. Наличие контрольной группы (инъекция физиологического раствора) в каждом опыте позволяло точно оценивать эффекты препаратов и в такой модификации процедуры, сравнивая с результатами, полученными в других сериях, где мышь помещали на перекресток.

Для результатов имеют значение вид и линия животных, освещенность, манипуляции перед тестом ПКЛ. Это и неудивительно, так как поведение мышей и крыс в ПКЛ представляет собой интегральный результат минимум трех мотиваций: ориентировочно-исследовательского рефлекса, норкового рефлекса (рефлекса предпочтения темноты) и страха высоты. Интенсивность этих мотиваций определяется конкретными контролируемыми условиями методики ПКЛ. Например, при большей освещенности усилен норковый рефлекс, а при повторном тестировании угашен ориентировочный рефлекс. Известно, что многие тестируемые препараты могут изменять все три мотивации, причем в неодинаковой пропорции. В зависимости от этого интег- ральный эффект может быть различным.

При повторном помещении мыши или крысы в ПКЛ типичным является более быстрое убегание из открытого рукава (Rodgers et al., 1996). Такое поведение обычно интерпретируют как увеличение страха перед высотой. Трехкратным ежедневным тестированием мыши в ПКЛ удается отбирать мышей (линии C57Bl/6, но не SHR) с высокой тревожностью для дальнейшего использования их как модели тревоги (Лапин И. П., Мирзаев С., 1996).

Различия в деталях конструкции ПКЛ сказываются на результатах теста. Так, небольшие уступы (борта) краев открытых рукавов уменьшают анксиолитический эффект хлордиазепоксида на крысах во время повторного тестирования (через 24 ч после первого), в то время как при первом тестировании этот эффект был отмечен только в конструкции, где не было бортиков (Fernandez, File, 1996). Обширная информация о роли деталей конструкций ПКЛ и факторов процедуры суммирована и проанализирована в литературе (Hogg, 1996).

Наш опыт работы со стандартными анксиогенами и анксиолитиками показал (Лапин И. П., 2000), что самым надежным показателем поведения мышей в ПКЛ является количество свешиваний с края открытых рукавов. Все испытанные анксиогены: коразол, кофеин, йохимбин, фенилэтиламин, кинуренин постоянно вызывали урежение свешиваний, а испытанные анксиолитики: диазепам, хлордиазепоксид, гидроксизин (атаракс), мепробамат и фенибут учащали свешивания. Превосходство этого показателя поведения в ПКЛ над другими объясняется, по-видимому, тем, что он связан наиболее прямо со страхом высоты, а иные названные выше мотивации имеют намного меньшее значение. Именно во время свешивания животное воспринимает высоту. Без свешиваний оно перемещается, как показали наши специальные сравнения, почти одинаково в ПКЛ и КЛ, опущенном на стол.

В заключение можно сказать, что, если тщательно выполнять все названные выше контроли (на воспроизводимость, надежность, стрессорные факторы) и не упускать из вида «подводные камни» каждой методики, все три модели тревоги на мышах как простые, быстрые и точные могут успешно применяться в фармакологическом эксперименте.


Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Можно использовать следующие HTML-теги и атрибуты: <a href="" title=""> <abbr title=""> <acronym title=""> <b> <blockquote cite=""> <cite> <code> <del datetime=""> <em> <i> <q cite=""> <strike> <strong>

Хостинг КОМТЕТ